環境DNAで使われているメタバーコーディングプライマーを中心にまとめました。
基本的にMi ~と名の付くプライマーはMiseqの150PEで解読できるようになっているそうです。
この記事の内容
魚類 (Osteichthyes, Chondrichthyes, Cyclostomata)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| MiFish-U-F (硬骨魚類) | GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC | Miya et al. 2015 |
| MiFish-U-R (硬骨魚類) | CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG | Miya et al. 2015 |
| MiFish-Ev2-F (軟骨魚類) | RGTTGGTAAATCTCGTGCCAGC | 環境DNA マニュアル |
| MiFish-Ev2-R (軟骨魚類) | GCATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG | 環境DNA マニュアル |
| MiFish-U2-F (アナハゼ類) | GCCGGTAAAACTCGTGCCAGC | 環境DNA マニュアル |
| MiFish-U2-R (アナハゼ類) | CATAGGAGGGTGTCTAATCCCCGTTTG | 環境DNA マニュアル |
| MiFish-L-F (ヤツメウナギ類) | GCTGGTAAACCTCGTGCCAGC | 環境DNA手順書 |
| MiFish-L-R (ヤツメウナギ類) | CATAGCGGGGTATCTAATCCCGGTTTG | 環境DNA手順書 |
U, Ev2, U2を混合して使用する場合は環境DNAマニュアルの比率を参考に2:1:1で混合する。
また、アユ(Plecoglossus altivelis altivelis)がバイオマスに対して、環境DNAメタバーコーディングの結果が合わない場合があるといった声を多く聞きます。
絶妙な位置にある数点ミスマッチが原因なような気がします。アユのプライマーを作って入れてもいいでしょう。
甲殻類 (Decapoda)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| MiDeca-F | GGACGATAAGACCCTATAAA | Komai et al.2019 |
| MiDeca-R | ACGCTGTTATCCCTAAAGT | Komai et al.2019 |
甲殻類というより十脚目用のユニバーサルプライマーです。現状のデータベースの状態で、メタバーコーディングをすると種まで落ちない配列が多い印象です。ですが、令和２年度戦略的研究開発課題で無脊椎動物の基盤データ整備が挙げられているので、甲殻類についても近いうちに解像度が上がるかもしれません。
哺乳類 (Mammalia)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| MiMammal-U-F | GGGTTGGTAAATTTCGTGCCAGC | Ushio et al.2016 |
| MiMammal-U-R | CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG | Ushio et al.2016 |
| MiMammal-E-F (象) | GGACTGGTCAATTTCGTGCCAGC | Ushio et al.2016 |
| MiMammal-E-R (象) | CATAGTGAGGTATCTAATCTCAGTTTG | Ushio et al.2016 |
| MiMammal-B-F (熊) | GGGTTGGTTAATTTCGTGCCAGC | Ushio et al.2016 |
| MiMammal-B-R (熊) | CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG | Ushio et al.2016 |
陸上に生息する哺乳類を水から検出するといったアプローチで種を検出します。最近は夜行性の哺乳類であるカワネズミ(Chimarrogale platycephalus)の検出に用いられたりもしています。ただ、哺乳類を対象としているので、ヒトのコンタミネーションにはより一層の注意が必要。
鳥類 (Aves, Bird)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| MiBird-U-F | GGGTTGGTAAATCTTGTGCCAGC | Ushio et al.2018 |
| MiBird-U-R | CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG | Ushio et al.2018 |
水鳥などの鳥類相の調査に用いたりします。鳥類が少ないとヒトが増えたり魚類が増えたりする場合があります。
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| BirT-F | YGGTAAATCYTGTGCCAGC | Thalinger eta. 2023 preprint |
| BirT-R | AAGTCCTTAGAGTTTYAAGCGTT | Thalinger eta. 2023 preprint |
プレプリントなのでポテンシャルは未知だが、割と良さげな印象。
水棲昆虫 (Insecta, Water invertebrate)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| LCO1490 | GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG | Folmer et al.1994 Uchida et al.2020 |
| HCO2198 | TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA | Folmer et al.1994 Uchida et al.2020 |
- Uchida et al.2020に記載のLCO1490-HCO2198 (Folmer et al.1994) のプライマーセットは増幅産物長がMiseqの最大可読長である600bpを上回っているため、フォワード側とリバース側の配列を解析時にマージできないことに注意して使用する。
- Uchida et al.2020に記載のLCO1490はFolmer et al.1994に記載の配列と異なるため原著論文を要確認。
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| fwhF2 | GGDACWGGWTGAACWGTWTAYCCHCC | Vamos et al2017 |
| EPTDr2n | CAAACAAATARDGGTATTCGDTY | Leese et al.2020 |
- fwhF2-EPTDr2nのプライマーセットは日本で使用する場合、目的とする分類群が増幅するかどうか確認してから使用することを推奨する。
- EPTDは指標生物であるカゲロウ目(Ephemeroptera), カワゲラ目(Plecoptera), トビケラ目(Trichoptera), ハエ目(Diptera)の略。
過去に検証して見た結果、カゲロウ目の種やユスリカがかなり優先して検出された。
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| MtInsects-16S_F | GGACGAGAAGACCCTWTAGA | Takenaka et al.2023a (開発論文) Takenaka et al.2023b (環境DNA適用プレプリ) |
| MtInsects-16S_R | ATCCAACATCGAGGTCGCAA | Takenaka et al.2023a (開発論文) Takenaka et al.2023b (環境DNA適用プレプリ) |
- 対象が昆虫であるため、同じ地点でfwhF2-EPTDr2nと同時に使用すると異なる水生昆虫相が得られる。現状並列して使用するのがおすすめ。
- オイカワ増幅する。
どちらのバーコーディングプライマーもトンボ目が増幅されづらい。
菌叢 (Bacteria)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| 341F | CCTACGGGAGGCAGCAG | |
| 515F | GTGCCAGCMGCCGCGGTAA | |
| 806R | GGACATACHVGGGTWTCTAAT |
サンショウウオ類 -サンショウウオ属 – (Hynobius)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| Hynobius_12S_F1 | TTAATAAAAACGGCCTAAAGCGTG | Sakai_et_al.2019 |
| Hynobius_12S_R1 | TCAATTATAGAACAGGCTCCTCTAGGG | Sakai_et_al.2019 |
ウナギ属 (Anguilla)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| MiEel-F | CTTACAGCAAACCTGACAGCAG | Takeuchi et al.2019 |
| MiEel-R | TTGGTGTGCCATTATACGTTTTCTTG | Takeuchi et al.2019 |
両生類 (Amphibia)
| プライマー名 | 配列(5’→3′) | 出典 |
| Amph_16S_1070F | ACGAGAAGACCCYRTGGARCTT | Sakata et al.2022 |
| Amph_16S_1340R | ATCCAACATCGAGGTCGTAA | Sakata et al.2022 |
- 論文中のプライマー作成の部分に、InSilicoで魚類・哺乳類・鳥類の増幅が考えられる旨の記載があるため、両生類以外の生物種が同所的に生息しておりバイオマス量の偏りが大きい場合には、データ量を多く取得しないとバイオマス量の少ない両生類が検出されない可能性あり
棘皮動物 – クモヒトデ綱 – (Ophiuroidea : 16SOph1, Echinodermata : 16SOph2)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| 16SOph1-F | GTACTCTGACYGTGCAAAGGTAGC | Okanishi et al.2023 |
| 16SOph1-R | TAGGGACAACACGTCCCRCT | Okanishi et al.2023 |
| 16SOph2-F | GGACGAGAAGACCCYRTWGAG | Okanishi et al.2023 |
| 16SOph2-R | CAACATCGAGGTCGCAAAC | Okanishi et al.2023 |
イシサンゴ目- (Scleractinian)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| Scle_12S_Fw | CCAGCMGACGCGGTRANACTTA | Shinzato et al.2021 (開発) Nishitsuji etal.2023 (実証研究) |
| Scle_12S_Rv | AAWTTGACGACGGCCATGC- | Shinzato et al.2021 (開発) Nishitsuji etal.2023 (実証研究) |
ハプロタイプ検出用プライマー
特定の種内多型を環境DNA分析で検出するためのプライマーセット
アユ (Plecoglossus altivelis altivelis)
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| PaaDlp-2_F | CCGGTTGCATATATGGACCTATTAC | Tsuji et al.2020 (開発) Tusji et al.2022 (実証研究) |
| PaaDlp-2_R | GCTATTRTAGTCTGGTAACGCAAG | Tsuji et al.2020 (開発) Tusji et al.2022 (実証研究) |
ドンコ属 (Odontobutis obscura, O. hikimius)
既存のドンコ2種を含む複数系統を増幅するプライマー
| プライマー名 | 配列 (5’→3′) | 出典 |
| Odon_12S primer-F | TATACGAGAGGCTCAAGCTGAT | Tsuji etal.2023 (原著) Tusji etal.2023 (プレプリ) |
| Odon_12S primer-R | GTTTTACCAGTTTTGCTTACTATGG | Tsuji etal.2023 (原著) Tusji etal.2023 (プレプリ) |
カワムツ, ヌマムツ, オイカワ (Nipponocypris temminckii, N. sieboldii, Zacco platypus)
オイカワ, カワムツ, ヌマムツの系統を増幅するプライマー (ハスが増えるので注意)
| NipZac_D-loop primer-F | ACTATCTTCTGATAGTAACCTATATGGTA | Tsuji etal.2023 (原著) Tusji etal.2023 (プレプリ) |
| NipZac_D-loop primer-R | GTGTCCCTGATTCTATCATGAATAG | Tsuji etal.2023 (原著) Tusji etal.2023 (プレプリ) |
※ Opsariichthys uncirostrisを増幅する
プライマーの確認等に使うもの
- Primer blast
- Reverse complement
(混合塩基が含まれているプライマーはこちらで実行) - 混合塩基確認
- 解像度確認
- 簡単なTmの確認
プライマーが対象分類群・種のDNAを増幅するかの確認
- rDoAMP(https://github.com/ong8181/rDoAMP)
随時追加していきます。
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プライマー配列は一度primer blastして期待する分類群を増幅するか、期待しない分類群を増幅していないか確認しましょう。
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