メタバーコーディングプライマー

環境DNAで使われているメタバーコーディングプライマーを中心にまとめました。
基本的にMi ~と名の付くプライマーはMiseqの150PEで解読できるようになっているそうです。

この記事の内容

プライマー名	配列(5’→3′)	出典
MiFish-U-F (硬骨魚類)	GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC	Miya et al. 2015
MiFish-U-R (硬骨魚類)	CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG	Miya et al. 2015
MiFish-Ev2-F (軟骨魚類)	RGTTGGTAAATCTCGTGCCAGC	環境DNA マニュアル
MiFish-Ev2-R (軟骨魚類)	GCATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG	環境DNA マニュアル
MiFish-U2-F (アナハゼ類)	GCCGGTAAAACTCGTGCCAGC	環境DNA マニュアル
MiFish-U2-R (アナハゼ類)	CATAGGAGGGTGTCTAATCCCCGTTTG	環境DNA マニュアル
MiFish-L-F (ヤツメウナギ類)	GCTGGTAAACCTCGTGCCAGC	環境D NA 手順書
MiFish-L-R (ヤツメウナギ類)	CATAGCGGGGTATCTAATCCCGGTTTG	環境DNA手順書

海域であればUとEv2, U2は混合して使用する。ヤツメウナギなどの円口類が生息している場合Lも混合して用いる。

U, Ev2, U2を混合して使用する場合は環境DNAマニュアルの比率を参考に2:1:1で混合する。

また、アユ(Plecoglossus altivelis altivelis)がバイオマスに対して、環境DNAメタバーコーディングの結果が合わない場合があるといった声を多く聞きます。

絶妙な位置にある数点ミスマッチが原因なような気がします。アユのプライマーを作って入れてもいいでしょう。

甲殻類というより十脚目用のユニバーサルプライマーです。現状のデータベースの状態で、メタバーコーディングをすると種まで落ちない配列が多い印象です。ですが、令和２年度戦略的研究開発課題で無脊椎動物の基盤データ整備が挙げられているので、甲殻類についても近いうちに解像度が上がるかもしれません。

プライマー名	配列(5’→3′)	出典
MiMammal-U-F	GGGTTGGTAAATTTCGTGCCAGC	Ushio et al.2016
MiMammal-U-R	CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG	Ushio et al.2016
MiMammal-E-F (象)	GGACTGGTCAATTTCGTGCCAGC	Ushio et al.2016
MiMammal-E-R (象)	CATAGTGAGGTATCTAATCTCAGTTTG	Ushio et al.2016
MiMammal-B-F (熊)	GGGTTGGTTAATTTCGTGCCAGC	Ushio et al.2016
MiMammal-B-R (熊)	CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG	Ushio et al.2016

陸上に生息する哺乳類を水から検出するといったアプローチで種を検出します。最近は夜行性の哺乳類であるカワネズミ(Chimarrogale platycephalus)の検出に用いられたりもしています。ただ、哺乳類を対象としているので、ヒトのコンタミネーションにはより一層の注意が必要。

プライマー名	配列(5’→3′)	出典
MiBird-U-F	GGGTTGGTAAATCTTGTGCCAGC	Ushio et al.2018
MiBird-U-R	CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG	Ushio et al.2018

超可変領域長約171bp

水鳥などの鳥類相の調査に用いたりします。鳥類が少ないとヒトが増えたり魚類が増えたりする場合があります。

プライマー名	配列(5’→3′)	出典
LCO1490	GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG	Folmer et al.1994 Uchida et al.2020
HCO2198	TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA	Folmer et al.1994 Uchida et al.2020

Illuminaシーケンサーなら600cycle (300PE) のカートリッジでシーケンス

Uchida et al.2020に記載のLCO1490-HCO2198 (Folmer et al.1994) のプライマーセットは増幅産物長がMiseqの最大可読長である600bpを上回っているため、フォワード側とリバース側の配列を解析時にマージできないことに注意して使用する。
Uchida et al.2020に記載のLCO1490はFolmer et al.1994に記載の配列と異なるため原著論文を要確認。

プライマー名	配列(5’→3′)	出典
fwhF2	GGDACWGGWTGAACWGTWTAYCCHCC	Vamos et al2017
EPTDr2n	CAAACAAATARDGGTATTCGDTY	Leese et al.2020

Illuminaシーケンサーなら300cycle (150PE) の以上のカートリッジでシーケンス

fwhF2-EPTDr2nのプライマーセットは日本で使用する場合、目的とする分類群が増幅するかどうか確認してから使用することを推奨する。
EPTDは指標生物であるカゲロウ目(Ephemeroptera), カワゲラ目(Plecoptera), トビケラ目(Trichoptera), ハエ目(Diptera)の略。

過去に検証して見た結果、カゲロウ目の種やユスリカがかなり優先して検出された。

Illuminaシーケンサーなら500cycle (250PE) の以上のカートリッジでシーケンス

どちらのバーコーディングプライマーもトンボ目が増幅されづらい。

341F-806はV3-V4領域を、515F-806RはV4領域を増幅

プライマー名	配列(5’→3′)	出典
Hynobius_12S_F1	TTAATAAAAACGGCCTAAAGCGTG	Sakai_et_al.2019
Hynobius_12S_R1	TCAATTATAGAACAGGCTCCTCTAGGG	Sakai_et_al.2019

Illuminaシーケンサーなら500cycleの以上のカートリッジでシーケンス

プライマー名	配列(5’→3′)	出典
MiEel-F	CTTACAGCAAACCTGACAGCAG	Takeuchi et al.2019
MiEel-R	TTGGTGTGCCATTATACGTTTTCTTG	Takeuchi et al.2019

論文中のプライマー作成の部分に、InSilicoで魚類・哺乳類・鳥類の増幅が考えられる旨の記載があるため、両生類以外の生物種が同所的に生息しておりバイオマス量の偏りが大きい場合には、データ量を多く取得しないとバイオマス量の少ない両生類が検出されない可能性あり

Illuminaシーケンサーなら300cycleの以上のカートリッジでシーケンス

プライマー名	配列(5’→3′)	出典
Scle_12S_Fw	CCAGCMGACGCGGTRANACTTA	Shinzato et al.2021 (開発) Nishitsuji etal.2023 (実証研究)
Scle_12S_Rv	AAWTTGACGACGGCCATGC-	Shinzato et al.2021 (開発) Nishitsuji etal.2023 (実証研究)

産物長 366~465bpなので、Illuminaシーケンサーなら600cycleのカートリッジでシーケンス