MiFishメタバーコーディングレビュー論文訳　第三弾

魚類の環境DNAをメタバーコーディングするためのユニバーサルプライマー(MiFish : マイフィッシュ)の開発者本人によるレビュー論文の和訳第三弾です。まだ、数パート続きます。研究課題を考える学生さんや新しく始める人などの仕事や研究の手助けになれば嬉しいです@しばた

MiFishメタバーコーディング：環境DNAおよびその他のサンプルから複数の魚種を同時に検出するためのハイスループットなアプローチ
MiFish metabarcoding: a high-throughput approach for simultaneous detection of multiple fish species from environmental DNA and other samples

Introduction
競合するUniversal PCRプライマーとの性能比較
MiFishプライマーの分類学的最適化
望ましい実験室設定と改訂された実験プロトコルについて (今回はここ)
新しいバイオインフォマティクスパイプラインと参照データベース
さまざまな水生環境での実証研究のレビュー
1. 海の魚類群集
2. 淡水の魚類群集
3. 河口域の魚類群集
MiFishプライマーを用いた新しい技術の開発
他の生物へのMiFishメタバーコーディングの応用
バルクDNAサンプルへのMiFishメタバーコーディングの応用
さいごに
感想

1,2章の内容はこちら

3章の内容はこちら

4. 望ましい実験室設定と改訂された実験プロトコルについて

MiFishメタバーコーディングのための実験プロトコルは、沖縄の美ら海水族館の4つの水槽からの海水サンプルを使用して開発されました。

これらの水槽は周辺海域の魚類の種多様性を再現した、高密度環境であったため、これらの水槽からサンプリングされた環境DNAの濃度は高く、シーケンスのためのライブラリ調整は容易でした。

その後、沿岸・海洋水域、深海、河川、湖沼など様々な水域の幅広い緯度や標高で実証研究を行った結果、魚類の個体数密度が比較的まばらで、環境DNAの濃度が不明な環境水においては実験プロトコルが最適化されるべきであることが明らかになりました。

この結果を踏まえて著者らは実験プロトコルを改訂しました(環境DNA調査・実験マニュアル(Ver.2.2) 2020年4月3日) 。

また、環境DNAメタバーコーディングは外因性DNAの影響を非常に受けやすく、DNA抽出からライブラリの作成までのあらゆる実験ステップで汚染が起こり得ます。

以下は、MiFishメタバーコーディングのための最適な実験室設定と改訂された実験プロトコルについてまとめています。

実験環境について

環境DNAメタバーコーディングを成功させるための重要な課題の一つは、外因性DNAの影響を受けにくい実験環境を設定することです。

このような外因性DNAの供給源は様々なものが考えられ、偽陽性などは環境DNAメタバーコーディングに深刻な悪影響を及ぼします(Miya et al. 2015)。

外因性 DNA の影響を避けるために、環境DNAメタバーコーディングを行う実験室は以下の条件ごとに3 室に分けておく必要があります。

環境DNAの抽出 (Fig.9a)
PCRの準備 (Fig.9b)
PCRとPCR後の作業場 (Fig.9c)

Fig. 9 — Fig.9 千葉県立博物館の3つの実験室を物理的に分離した1例
(a)環境DNAの抽出 (b)PCRの準備 (c)PCRとPCR後の作業場

またキャリーオーバーなコンタミネーション(汚染)を避けるため、それぞれの部屋には個別に冷蔵庫、冷凍庫、遠心機、ラボコート、ピペット、Milli-Q ウォーターディスペンサーなどが必要となります(Sefers and Schmitz 2018)。

そして、各実験ステップに専用の部屋を用意して空間的に分離することに加えて、第3室 (PCRとPCR後の作業部屋) から他の部屋へアンプリコン (増幅されたDNA断片) を持ち込まないようにするために「一方通行ルール」を守る必要があります。

PCR増幅とチェックを行った後に、同日に同じ担当者が追加の環境DNAの実験を行わない、すべての機器は新品で未使用のものか、DNAフリーのものを使用する必要があります。

コンタミネーションフリーな環境DNAの実験に関する注意事項については、環境DNA学会のマニュアルを参照してください。

海水サンプルのろ過法の検討

海水サンプルへのプロトコルの最適化の中でMiFishプライマーが時折、PCRの増幅に失敗することがあります。

最も可能性の高い理由の1つとして、試料水中に十分な量の鋳型DNAが無かったことが考えられます(Miya et al.2016)。

特定分類群の環境DNA濃度は増幅前には不明ですが、大容量の水（> 1 L）をろ過することは、外洋や深海の生態系のような魚類の豊富さとバイオマスが乏しい環境から、より多くの環境DNAを収集するための簡単で効果的な方法です。

Sterivex DNA extraction — https://www.protocols.io/view/sterivex-dna-extraction-bc2hiyb6

多くの魚類の環境DNAに関する研究(Rees et al. 2014)で使用されてきたディスクフィルターに比べて、カートリッジフィルター(Sterivex©; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)は、以下の利点があります。

目詰まりする前に、より大きな水量に対応可能(Walsh et al. 2009)
個別包装なので無菌
実験ワークフローのいくつかのステップをフィルターハウジング内で実行可能(抽出の最初のステップ？)

これらの利点により、実験室由来の汚染の可能性を低減することができます。

SterivexとGF/Fフィルターの比較

Miya et al.2016はこれらの点を考慮して、Sterivexを用いた水試料のろ過の後、環境DNAを抽出するためのプロトコルを開発し、SterivexとGF/Fフィルターからの環境DNA抽出プロトコルを海水の水槽サンプルを使って比較しました。

MiFishメタバーコーディングによる解析を行ったところ、SterivexにはGF/Fフィルターを用いた場合より、検出された種数が有意に多いという結果になりました（Fig.10）。

この知見は、環境DNAの捕獲効率に対するろ過方法の効果を比較したその後の研究とも一致しています(Spens et al. 2016; Li et al. 2018; Capo et al. 2020）。

さらに最近では、Oka et al. 2020では、アスピレーターを用いた並列ろ過システムを開発し、14個の1L水サンプルを同時にろ過することが可能で、フィルターの目詰まりが起こりにくいことを示しました(論文 Fig.11)。

Fig.11 最大14本のステリベックスを同時にろ過できる手作り装置(Oka et al., 2020)
フィルターの目詰まりを起こしにくく、水サンプル1Lを1時間以内にろ過可能

現在、MiSeqのペアエンドシークエンシング　(増幅されたDNAの両端から配列を解読) は、2段階のテイルドPCR (目的の部分の両端に識別プライマーをつける) アプローチを採用してライブラリを構築しています(Fig.1)。

Fig. 1 図1 MiSeqシーケンシングのための2段階のtailed PCRによるペアエンドライブラリー調整の模式図。 (a)オーバーハングアダプター配列（オレンジ）を有する一対のMiFishプライマー（青）を用いて着目する領域を増幅するための1st PCR、(b)デュアルインデックス（赤）とシーケンシングアダプター（緑）を追加するための2nd PCR。(Miya et al. 2015をちょっと改変)

構築されたライブラリはプライマーと3つのアダプター配列を両端に介在させた魚に由来する超可変領域のみで構成されています(Fig.1b)。

しかし、MiSeqでの配列決定に失敗した場合、プライマーとアダプターの2つの領域の間のMiFish配列が欠落していたり、魚類以外の生物由来の配列に置換されていたりすることがあります。

このようなライブラリ作成の失敗を避けるためには、以下のことが重要です。

スピンカラムまたはビーズを使用して、1st PCR産物を精製して、冗長なテールプライマーおよびプライマーダイマー（ハイブリダイズドテールプライマー分子）を除去する
BioAnalyzerまたはTapeStationなどの自動電気泳動システムを使用して精製した第1回PCR産物を定量する
定量した第1回PCR産物を一定濃度(例えば、0.1 ng/μl)に希釈し、第2回PCR（第2回PCR）のテンプレートとして使用する
ゲル電気泳動を使用して370 bp付近の第2回PCR産物をサイズ選択し、440 bp付近の余分なバンドを除去する