MiFishプライマーに関するレビュー論文 Part2

魚類の環境DNAをメタバーコーディングするためのユニバーサルプライマー(MiFish : マイフィッシュ)の開発者本人によるレビュー論文の和訳第二弾です。まだ、数パート続きます。研究課題を考える学生さんや新しく始める人などの仕事や研究の手助けになれば嬉しいです@しばた

MiFishメタバーコーディング：環境DNAおよびその他のサンプルから複数の魚種を同時に検出するためのハイスループットなアプローチ
MiFish metabarcoding: a high-throughput approach for simultaneous detection of multiple fish species from environmental DNA and other samples

Introduction
競合するUniversal PCRプライマーとの性能比較
MiFishプライマーの分類学的最適化 (今回はここ)
望ましい実験室設定と改訂された実験プロトコルについて
新しいバイオインフォマティクスパイプラインと参照データベース
さまざまな水生環境での実証研究のレビュー
1. 海の魚類群集
2. 淡水の魚類群集
3. 河口域の魚類群集
MiFishプライマーを用いた新しい技術の開発
他の生物へのMiFishメタバーコーディングの応用
バルクDNAサンプルへのMiFishメタバーコーディングの応用
さいごに
感想

1,2章の内容はこちら

3. MiFishプライマーの分類学的最適化

MiFishプライマーが他のプライマーより優れている点が多いことは実証されてきました。

その一方で、克服すべき点がいくつかあります。ここでは、”PCRのドロップアウトによる偽陰性”と”種判別領域が複数種間で一致する問題”の2点について研究例に沿って説明していきます。

PCRのドロップアウトによる偽陰性について

MiFish-E -E2

Miya et al.,2015ではPCR時のドロップアウトについて、水槽内で飼育されているサメやエイなどの軟骨魚類や板鰓類(elasmobranchs)がMiFishのオリジナルプライマーで増幅されませんでした。

著者らはプライマーと鋳型となるDNAのミスマッチに起因するPCRのバイアスに起因するのではないかとの疑念から、軟骨魚類や板鰓類(Elasmobranchs : E)のプライマーが引っ付く部位の配列変異に対応するために新しいプライマーペア(MiFish-E)を設計しました。

その後、このプライマーを使うことで、水槽内に飼育されている17種の硬骨魚類と板鰓類のすべてを検出することに成功しました。

しかし、その後の研究により、MiFish-Eではアニーリング温度の上昇とともに軟骨魚類や板鰓類の検出確率が著しく低下することが明らかになりました(Fig.6 From Doi et al.2019)。そこで、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方の5´末端に1塩基を追加したMiFish-E2を作成してプライマーの融解温度を上昇させることで、検出率の温度依存性を緩和しました(Miya and Sado 2019a)。

MiFish-U2

日本中部の太平洋沿岸で一般的な岩礁に生息する海のカサゴ4属10種 : Pseudoblennius, Furcina, Ocynectes, Vellitor (Scorpaeniformes: Cottidae) は、検出されてもごくわずか、もしくは完全に検出されないことがありました。

MiFishのプライマーがひっつく部位をサンガーシークエンシング(DNA配列の決定)したところ、MiFish-Uのプライマーと鋳型DNAにミスマッチが1～6個あることが明らかになりました(論文Fig.7a)。

これらの10種の配列の変異に対応するように(MiFish-U2)を開発し、その後の野外調査により、地域の魚類群集組成をより正確に反映する合理的な結果が得られました(M. Miya , unpublish data)。

著者の研究室では、MiFish-U-F/R: MiFish-E-F/R : MiFish-U2F/R ＝ 2 : 1 : 1のプライマーミックスを用いて、1st PCRを行い、海産魚類相からの環境DNAを増幅してきました(Miya and Sado 2019a)。

これら2つの例は、実際の調査を開始する前に、対象となる調査海域からのいくつかの水サンプルに基づいて、MiFishプライマーを用いた予備実験を行うことが重要であることを強く示唆しています。

予備実験の結果を捕獲による直接観察や水中で目視観察調査、文献調査による過去の生息記録と比較することで、予備実験の結果に欠落している一般的な種の中で明らかな偽陰性種(または種のグループ)を本調査の前に見つけることができます。

プライマーバイアスがかかりそうなその他の種について

日本の淡水魚類においてはヤツメウナギ(Lethenteron and Lampetra)やその他数種(アユ: Plecoglossus altivelis, ワカサギ属: Hypomesus spp.)が、MiFishメタバーコーディングのデータでは既知の分布や個体数とに比べて、過小評価されている可能性があり、それはやはりプライマーと鋳型DNAのミスマッチによるものと考えられています(論文Fig.7b, c)。

さらに類似した例がオーストラリアのパースでタツノオトシゴ類( Syngnathidae科)について報告されています。Nester et al. 2020では、新規開発されたプライマーによってタツノオトシゴ属を検出することができたものの、MiFishを含む既存のプライマーセットでは偽陰性でした。しかしこの知見は、MiFishのプライマーを用いて2種のタツノオトシゴを検出したTang et al. 2018とは対照的な結果でした。